龙牡壮骨颗粒治疗大鼠佝偻病药效学及其机制

刘秀兰1  , 向明1  , 李亚洲2  , 翟莉2  , 游东阁2  , 肖飞2           （1 .  华中科技大学同济医学院药学院，湖北 武汉 430030;2.  武汉健民药业技术发展中心，湖北 武汉 430052）

［摘要］   目 的：研究中药复方龙牡壮骨颗粒对维生素 D 缺乏佝偻病的药理作用及作用机制 。方法：将 30 只雄性 SD 大 鼠 随机均分为空 白组，模型组和龙牡壮骨颗粒组，模型组和龙牡壮骨颗粒组用维生素 D 缺乏饲料喂养并避光处理 4 周诱导维生素 D缺乏性佝偻病，之后给予正常饲料 。 空 白组和模型组给予0. 9%生理盐水、龙牡壮骨颗粒组给予龙牡壮骨颗粒水剂，灌 胃给药，每天一次，连续给药 8 周 。期间每周检测大鼠体质量变化，给药结束后处死大鼠，检测身长、骨形成、代谢、血生化指标以及钙跨膜转运相关蛋白变化 。 结果：龙牡壮骨颗粒能显著增加佝偻病大鼠体质量和身长（P<0 . 05） ；同时提高骨干重、骨灰重、骨密度、血磷、25-羟基维生素 D3 [25（OH） D3 ] 含量及显著降。低碱性磷酸酶（ALP） 及抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP） 含量（P< 0 . 05） ,其中骨钙含量和血钙含量增加尤其明显（P<0 . 01） ；深入研究发现其能显著增加钙转运蛋白（CAT1） 和维生素 D 受体（VDR） 蛋 白表达量，并能一定程度地提高质膜钙泵（ATP2B1） 蛋 白的表达 。 结论：龙牡壮骨颗粒能显著增加佝偻病大鼠对钙的吸收及跨膜转运能力，并能促进小肠对维生素 D 的摄取，增加佝偻病大鼠骨钙、骨盐含量，发挥治疗佝偻病作用。

［关键词］  佝偻病；龙牡壮骨颗粒；骨代谢；钙转运蛋 白；维生素 D 受体

Effects and mechanism of actions of Longmu Zhuanggu granules in rickets rats

LIU Xiu-lan1  ,  XIANG Ming1  ,  LI Ya-zhou2  ,  ZHAI Li2  ,  YOU Dong-ge2  ,  XIAO  Fei2  （1 . School of Pharmacy , Tongji Medical College ,  Huazhong University of Science and Technology ,  Hubei Wuhan 430030 ,  China ;  2 . Wuhan Jianmin Pharmaceutical Technology Development Center ,  Hubei Wuhan 430052 ,  China. ）

ABSTRACT: OBJECTIVE    To  investigate the therapeutic effects and the mechanisms of actions of Longmu Zhuanggu granules in rickets rats . METHODS    Thirty SD rats  were randomly divided into three groups ,  namely  control group ,  model  group and  Longmu Zhuanggu granules group.  The mice of model group and Longmu Zhuanggu granules group were fed with vitamin D deficiency diet and shielded from light for 4 weeks to induce rickets .  After being administrated with Longmu Zhuanggu granules by gavage every day for 8 weeks ,  the body weight and  length of rats were measured every week.   After mice were sacrificed , the dry weight ,  density and calcium content of the femur were detected to confirm the effects of Longmu Zhuanggu granules on bone formation and resorption.  Blood biochemical indicators were detected too.  To investigate the potential mechanisms ,  ex- pression of several calcium transport related proteins in small intestine were tested. RESULTS    Longmu Zhuanggu granules was effective on increasing the body weight and length of rickets rats（ * P<0 . 05） ,  and  could  elevate bone dry weight ,  bone  ash weight ,  bone mineral density ,  blood  phosphate ,  25（OH） D3    and it also could lower the level of ALP and TRAP in the blood significantly （P<0 . 05） ,  while the bone  calcium and  blood  calcium  were increased  （P < 0 . 01） .   It  was  found  that Longmu Zhuanggu granules could obviously up-regulate the expression of CAT1 ,  VDR and ATP2B1 . CONCLUSION    Longmu Zhuang- gu granules can elevate bone calcium and mineral content by augmenting calcium absorption ,  calcium  transport  and promoting the intake of vitamin D in the small intestine ,  which may play critical roles on rickets treatment.

KEY WORDS: rickets ;  Longmu Zhuanggu granules ;  bone metabolism ;  CaT1 ;  VDR

龙牡壮骨颗粒采用中西结合配方，既含有龙骨、牡蛎、龟板等富含钙、磷的中药成分，也有维生素 D、葡萄糖酸钙、乳酸钙等西药成分 。 该配方具有强筋壮骨、补脾补 肾、益气滋 阴[1]  的功效，用于预 防和治疗小儿佝偻病、软骨病，对 小 儿 多汗、夜惊、食欲 不振、消化不良、发育迟缓也有治疗作用 。尽管龙牡壮骨颗粒已广泛用于临床并取得了 良好的社会效益，但仍缺乏系 统性相 关研 究，作 用机制也尚未阐明。本实验旨在深入研 究 龙牡壮骨颗粒 治疗 维 生 素 D缺乏性佝偻病的药理作用及作用机制，为 临床用药提供准确依据。

1    材料与方法

1 . 1    材料

1 . 1 . 1     仪器  SX2-5-10 型箱式节能电阻炉（南 京宝都仪器有 限 公 司）；SynergyTM HT 多功 能酶标仪和 SYNGENE 化学发光成像系统（美 国 BioTek 公司）；TGL-16A 高速离心机（长沙平凡仪器仪表有 限公司）；FAI004 电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公 司）；YLS-7B 容积测量仪（济南益延科技发展有限公司）；VE-180 垂直 电泳槽（Tanon Science  & Technolog 公司）。

1 . 1 . 2    药物与试剂  本实验所用龙牡壮骨颗粒由武汉健民股份有限公司配成试验 浓 度 溶液（批 号20130501），并分装存储于-40  ℃备用 。 龙牡壮骨颗粒由党参、黄芪、山麦冬、醋龟甲、炒白术、山药、醋南五味子、龙骨、煅牡蛎、茯苓、大枣、甘草、乳酸钙、炒鸡内金、维生素 D、葡萄糖酸钙组成；维生素 D3   缺乏饲料（ 北 京 华 阜 康 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司，批 号20130103） 配方：玉米面 76% , 蛋清粉 5% , 小麦麸质13% , 碳酸钙 5% , 氯化钠 1% 。 正常饲料生产许可证号：SCXK:2011-0011 。0 . 9%氯化钠注射液（武汉滨湖双鹤药业有 限 公 司，批号 121002904）；钙测定试 剂 盒 、血 清 无 机 磷 测 定 试 剂 盒 、碱 性 磷 酸 酶（ALP） 试剂盒（南京建成生物工程研 究所）；抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒、25-羟基维生素 D3 、BCA蛋白测 定试剂 盒、Western 组 织 细 胞 裂解 液、SDS- PAGE 蛋白上样缓冲液（碧云天生物技术研究所）；内参 β-actin 多 克 隆 抗 体、Goat-anti-Mouse IgG（ H +L） -HRP 、Goat-anti-Rabbit IgG（ H+L） -HRP（天津三箭生物技术有 限 公 司）；VDR 单克 隆抗体（ab- cam 公司）；CAT1 多克 隆抗体（Proteintech 公 司）； ATP2B1 多克隆抗体，（ Millipore 公司）。

1 . 1 . 3    动物  SPF 级 3 周龄雄性 SD 幼年大 鼠 30只，体质量 50 g 左右，购自武汉大学动物 中心，合格证号：SCXK（鄂）2008-0004 。

1 . 2    实验方法

1 . 2 . 1     实验设计和分组  采用 随机分组法将 3 周龄 SD 雄性大 鼠分为 空 白组、模 型组和龙牡壮骨颗粒组，每组 10 只，所有动物饲养于华 中科技大学 同济医学院实验动物中心 。模型组和龙牡壮骨颗粒组给予缺乏维生素 D3   饲料并进行避光处理 4 周，空白组给予等量正常饲料。

1 . 2 . 2    给药方式  实验用药 由龙牡壮骨颗粒剂溶于水制得，其成分为（0. 27 g生药 +0 . 33 μgVD+1 mg 葡萄糖酸钙 +0.25 mg乳酸钙）/ml , 依据《药理学实验方法》第 4 版（人 民卫生 出版社）动物剂量换算表设定，大鼠等效剂量为人用剂量的 6 倍，经临床用药剂量（3 周龄大鼠相当于人类青春期前，该处 临床用药剂量为 7 岁儿童剂量）换算大 鼠龙牡壮骨颗粒溶液剂灌胃剂量为 1 ml/100 g , 空 白组和模型组给予0. 9%氯化钠注射液，治疗组给予龙牡壮骨颗粒水剂，灌胃给药 1  ml/100 g, 每天 1  次，连续给药 8周 。给药结束后处死大 鼠，处死前禁食 12  h , 作各项观察指标检测。

1 . 3    测定指标

1 . 3 . 1    一般情况  实验期间观察大鼠一般体征、外观、行为，每周称体质量 1 次。

1 . 3 . 2    龙牡壮骨颗粒对大鼠骨形成和代谢[2]  影响处死大鼠后分离右腿股骨，剥 肉洗净并于 105  ℃烘箱中烘干至恒重，称量骨干重；大鼠右腿股骨于容积测量仪中测定骨体积并计算平均骨密度 。取大鼠右腿股骨于高温电阻炉加热，升温至 500 ℃并恒温 30 min , 后升温至 700  ℃并恒温 1  h , 待灰化后称定骨灰重，取出后溶解在 6 mol·L-1 盐酸中，使用钙试剂盒测定骨钙含量。

1 . 3 . 3    龙牡壮骨颗粒对大鼠血生化指标[3]  影 响

大腿股动脉取血 10 ml 并静置于 4 ℃冰箱，2 h 左右待血 清 析 出 并 于 冷 冻 离 心 机 上 4  ℃ 、3  000  r · min-1 、离心 10 min , 取上层血清，采用钙试剂盒测定血钙含量；运用孔雀绿直接显色法检测血磷含量；分别用碱性磷酸酶检测试剂盒、抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒和 25-羟基维生素 D3 检测试剂盒检测血清 中 碱 性 磷 酸 酶 （ ALP）、酒 石 酸 酸 性 磷 酸 酶（TRAP） 和 25-羟基维生素 D3 [25（OH） D3 ] 含量。

1 . 3 . 4    龙牡壮骨颗粒对大鼠左股骨钙化程度影响采用钙盐硝酸银染色法检测左股骨钙化程度 。分离大鼠左腿股骨剥肉洗净并 固定于 4%缓冲 中性 甲醛液，按常规脱水包理，切片脱蜡至水后放入 2%硝酸银液并置于强 阳光处作用 15——60 min , 纯化水洗 3 min , 2%硫代硫酸钠液处理 2 min , 流水冲洗 5 min ,苏木素液染 4——5 min , 1%盐酸 乙醇分化，流水冲洗10——15  min , 曙 红 液 染 2  min 稍 水洗，常规脱 水透明，中性树胶封固，钙盐染色呈褐黑和棕黑色。

1 . 3 . 5     龙牡壮 骨颗粒对 小肠钙跨膜转运相关 蛋白[4] 表 达 量 影 响   Western  blotting  检 测 钙 转 运（CaT1） 蛋 白、维生素 D3    受体（VDR） 蛋 白、质膜钙泵（ATP2B1） 蛋 白表达量 的变化 。 取-80  ℃冻存 小肠组织，称取小肠组织 50 mg,加入 500 μl 组织细胞裂解液冰上研磨裂解，提取蛋 白，按 BCA 法蛋 白定量试剂盒操作说明测定蛋白含量，蛋白变性备用，制备 10%和 8%Tris-甘氨酸 SDS 聚丙烯酰胺凝胶，按每泳道 60 μg 蛋 白量上样，150 V 恒压 电泳 75  min分离后，转至 PVDF 膜，恒流转膜 60 min , 封 闭液常温封闭 1 h 后分别转入 CaT1 （1∶2  500）、VDR（1∶ 5 000）、ATP2B1（1∶2 500）、β-actin（1∶1 000） 的抗体孵育，4 ℃冰箱过夜，第 2 天取 出后，加入相应二抗（1∶ 5  000），37  ℃恒温箱孵 育 75  min , 取 出后 ECL显影 5 min 后，在化学发光仪上曝光。

1 . 3 . 6    统计学分析  采用 SPSS 13.0 统计处理软

件进行统计分析，结果 以 x-± s 表示，运用一维方差分析（One-way ANOVA） 进行 比较 ，以 P<0. 05为差异有统计学意义。

2    实验结果

2 . 1    龙牡壮骨颗粒对大鼠身长和体质量的影响

连续 4 周造模结束后，模型组大鼠出现的消瘦、活动减少、纳呆、拱背倦缩、食欲减退、毛色失泽等症状，且模型组大鼠体质量相比空白组 大 鼠有 显 著 降低（P<0. 01）；给药结束后，相对于模 型组，龙牡壮骨颗粒组体质量有显著升高（P<0. 01）；龙牡壮骨颗粒也能显著促进佝偻病大 鼠身长增加 （P <0. 05），结果见表 1 、图 1 。

表 1    龙牡壮骨颗粒对大鼠体质量和身长的影响（x-± s , n = 10）

Tab 1    Effects  of  Longmu  Zhuanggu  Granules on the mean body weight and length（x-±s , n=10）

组别	身长/cm	体质量/g
空 白组	26 . 78±0 . 65	469±48 . 58
模型组	25 . 7±0 . 66 a	415±16 . 43 a
龙牡壮骨颗粒组	26 . 41±0 . 90 b	457±40 . 56 c

注：与空 白组相比，aP<0 . 01；与模型组相比，bP<0 . 05 , cP<0 . 01

图 1    龙牡壮骨颗粒对大鼠体质量的影响（x-±s , n=10）

Fig 1     Effects  of  Longmu  Zhuanggu  granules  on  the mean body weight （x-±s , n=10）

2 . 2    龙牡壮骨颗粒对大鼠骨形成和代谢的影响

相对于空白组，模型组骨干重、骨灰重、骨密度、骨钙含量显著降低（P<0. 01）；相对于模型组，龙牡壮骨颗粒组 骨 干 重、骨灰重和骨密度均有升高 （ P < 0. 05），且骨钙含量显著 高于模 型组（P <0. 01）， 提示龙牡壮骨颗粒 能增加维生素 D 缺 乏所致佝偻病大鼠、骨密度及骨钙含量，维 持佝偻病 大 鼠骨骼健康，结果见表 2 。

2 . 3    龙牡壮骨颗粒对大鼠血生化指标影响  相对于空白组，模型组血钙、血磷及 25-羟基维生素 D3 显著降低（P <0. 01）， ALP 和 TRAP 显著升 高（P < 0. 01）；相对于模型组，龙牡壮骨颗粒 能显著升高血钙[5] 、血磷、25（OH） D3  , 且血钙升高效果更显著（P <0. 01），  同 时 其 能 显 著 降 低 血 清 中 ALP[6]    和TRAP 含量（P<0. 05）；且龙牡壮骨颗粒组与空白组各项血生化指标无明显差异，结果见表 3 。

2 . 4    龙牡壮骨颗粒对大 鼠股骨钙化程度影 响   由钙盐硝酸银对大鼠左腿股骨染色 图可知，模型组 中出现少量或微量的褐黑和棕黑色小 点，说 明骨钙化情况不明显；空白组中出现了一定量的褐黑和棕黑色的斑块，说明有一定的骨钙化；龙牡壮骨颗粒组中出现较多的褐黑和棕黑色斑块，说明骨钙化明显，结果见图 2 。

2 . 5    龙牡壮骨颗粒对小肠钙跨膜转运相关蛋白表达的影响相对于空白组，模型组大鼠小肠CAT1、VDR 蛋白表达均下调（P<0. 05）。 相对于模型组 ，龙牡壮骨颗粒能显著上调 CAT1 、VDR 蛋 白表达量（P<0. 05），龙牡壮骨颗粒对 ATP2B1 蛋 白表达有一定上调作用。 CAT1 为钙转运蛋白，可调控小肠内钙转运，促进小肠对钙 的 吸 收；VDR 蛋白为维生素D受体，维生素D与其结合后转运入细胞内，促进维生素 D 的 吸 收[7]  。 提示龙牡壮骨颗粒通过促进小肠对来治疗佝偻病，缓解佝偻病导致的相关缺钙、缺维生素D的症状，结果见图3 。

3    讨论                          

维生素 D 缺乏性佝偻病是 由体 内维生素 D 不足所引起钙、磷代谢失常，钙盐不能正常地沉着在骨骼生长部位的一种慢性营养缺乏性疾病[8]  。 随着医学技术的发展，人们意识到过度暴露于日照产生皮肤肿瘤的危 险和环境污染等现象 。 维生素D缺乏佝偻病在发达 国家和发展 中 国家有增高趋势[9]  , 特别是儿童，其生长发育迅速，厌食挑食情况均会导致维生素 D 和钙磷缺 乏，引起骨骺软骨生长不成熟，生长发育迟缓[10] 等慢性病理过程。

本实验通过分析大鼠行为学、体质量、身长等变化，检测大鼠骨形成和代谢、血生化指标、骨钙化程度，发现龙牡壮骨颗粒 组 能 显 著增加骨干重、骨 灰重、骨 密 度、骨 钙 含 量，并 能 明 显 增 加 血 钙、血 磷、25（OH） D3  的含 量，同 时 显 著 降 低 ALP 、TRAP 含量 。ALP 一般存在于成骨细胞 的细胞膜，常作为反映骨 形成的生化指标；TRAP 主 要 由 破 骨 细 胞 释放，是反映骨吸收的特征性酶，常作为反映破骨细胞活性[11]  。成骨细胞负责新骨形成，而破骨细胞吸收旧的骨组织，共同协调生物体 内正常 的骨转换和新陈代谢；提示龙牡壮骨颗粒 能够抑制佝偻病大 鼠血清中 ALP 、TRAP 含量的释放，维持血清 中 ALP 和TRAP相对平衡，能有效挽回佝偻病大鼠体 内异常的骨转换和代谢 。 25（OH） 2 D3  是维生素 D 在肝脏25-OH 羟化酶作用下生成 的 中 间代谢产物，其在血中浓度最高、最稳 定、半衰期 最长且又是合成活性1 , 25（OH） 2 D3 [12]  的前体 。 1 , 25（OH） 2  D3  可 以上调维生素 D 受体的表达量，是反映体内维生素 D 吸收的最佳指标 。此外，维生素 D 能增加肠道钙 的吸收和使血钙 增 高，血 钙 高 又 可 反 馈 减 少 甲 状 腺 激 素PTⅡ的释放[13]  , 从而 降低骨 吸 收 的作 用 。 血清 中25（OH） D3 含量升高提示龙牡壮骨颗粒能改善佝偻病大鼠体内维生素 D 含量不足 的现象，促进机体对维生素 D 的吸收和利用。

龙牡壮骨颗粒通过全面调整心、肾、脾 的功 能，以健脾为主，益气为辅，为运化吸收创造基本条件；龙骨、牡蛎以补钙为主，鸡 内金、茯苓直接促进消化和代谢 。龙牡壮骨颗粒能促进佝偻病大鼠对钙和维生素 D 的吸 收和利用，深入研 究其作用机制发现，龙牡壮骨颗粒能显著上调小肠上 CAT1  的表达量（P<0. 05），进而促进 ATP2B1 表达上调，为细胞 内摄取更多 Ca2+ 提供充足的能量，从而促进肠腔内的Ca2+ 摄入到小肠上皮细胞内，加强小肠对 Ca2+  的转运和吸收，恢复骨代谢的平衡；同时其能补充维生素D 等多种维生素[14]  , 增加机体对维生素 D 的吸收和利用，并促进 维 生 素 D 在肝脏中转化为活性 1 , 25 （OH） 2 D3  , 从而上调 VDR 的表达 （P<0. 05）。

综上 所 述，龙 牡 壮 骨 颗 粒 通 过 上 调 小 肠 上CAT1 ,  VDR ,  ATP2B1 蛋 白表达量，提 高血钙、血磷、25-羟基维生素 D3  含量，从而增加骨钙、骨密度含量，促进骨形成和骨代谢 。 本文初步阐明龙牡壮骨颗粒治疗维生素 D 缺乏佝偻病 的作用机制，为龙牡壮骨颗粒临床治疗提供理论依据和指导。

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［收稿 日期］2014-05-10
1-2014-龙牡壮骨颗粒治疗大鼠佝偻病药效学及其机制.pdf